TCVN 8710-28:2023 chẩn đoán bệnh thủy sản ở cá biển do vi rút rsiv

Vi rút red sea bream iridovirus - rsiv thuộc chi Megalocytivirus trong họ Iridoviridae, có hệ gen là một ADN mạch kép thẳng có kích thước ~ 112 kbp với hàm lượng G + C từ 53-55%. Vi rút này có hình đa diện 20 mặt, đường kính nhân 140-160nm, vỏ bao quanh đường kính 220-240nm. 

Bệnh truyền nhiễm do tác nhân của vi rút rsiv (red sea bream iridovirus) gây ra rất nguy hiểm ở nhiều loài cá khác nhau như cá tráp biển đỏ nuôi và ở hơn 30 loài cá biển thuộc họ Perciformes và Pleuronectiformes. Cá bị mắc bệnh trở nên lờ đờ, biểu hiện thiếu máu nghiêm trọng, đốm xuất huyết ở mang và lách to. Nếu không chẩn đoán kịp thời bệnh do vi rút này gây ra sẽ gây thiệt hại lớn đối với các loài cá biển.

Bộ Khoa học và Công nghệ đã công bố Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-28:2023 bệnh thủy sản - quy trình chẩn đoán - phần 28 bệnh do rsiv ở cá biển nhằm hướng dẫn các quy trình chẩn đoán bệnh do  vi rút rsiv ở cá biển. 

Để chẩn đoán trước tiên cần tiến hành thử nghiệm bằng cách sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác. Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung gồm Ethanol, từ 70% đến ethanol tuyệt đối và dung dịch muối đệm phosphate (PBS). 

Cá biển mắc vi rút vsiv gây ra những thiệt hại không nhỏ nên cần phải chẩn đoán kịp thời để hạn chế. Ảnh minh họa

Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp sinh học phân tử bao gồm cặp mồi xuôi và mồi ngược PCR; Cặp mồi (primes), gồm mồi xuôi và mồi ngược, dò (Probe) realtime PCR; Kít tách chiết ADN; Kít nhân gen PCR; Kít nhân gen realtime PCR; Dung dịch đệm TE; Thang chuẩn ADN (ladder/ marker); Nước tinh khiết, không có nuclease; Thạch agarose; Dung dịch đệm TAE hoặc TBE; Chất nhuộm màu; Chất đệm tải mẫu; Thuốc thử và vật liệu dùng cho phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào..

Nên sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ dùng chung như tủ lạnh, buồng cấy, ống đong, máy ly tâm, máy nghiền mẫu, cân phân tích, máy ủ nhiệt...

Về chẩn đoán lâm sàng bệnh loài cảm nhiễm rsiv ở cá tráp đỏ, cá tráp đen, cá tráp vây vàng, cá tráp đỏ, Cá cam Nhật Bản, cá thu lớn, cá háo sọc, cá ngừ vây xanh đại tây dương, cá sa ba...

Loài cảm nhiễm Infectious spleen and kidney necrosis virus (ISKNV): cá rô Trung Quốc, cá đù đỏ, cá đối đầu dẹt và cá mú. Loài cảm nhiễm Turbot reddish body iridovirus ở các loài cá bơn (Paralichthys olivaceus). 

Bệnh này thường xuất hiện ở mọi lứa tuổi tuy nhiên giai đoạn cá giống dễ bị nhiễm hơn giai đoạn trưởng thành. Tỷ lệ chết tùy thuộc vào loài cá nhiễm bệnh, kích thước, tuổi cá, nhiệt độ mà khác nhau (từ 0% đến 100%). Dịch bùng phát chủ yếu vào mùa hè ở nhiệt độ nước thích hợp từ 25°C trở lên. Bệnh lây truyền chủ yếu theo phương thức truyền ngang trong môi trường nước, khả năng truyền dọc (từ cá bố mẹ) của vi rút chưa được nghiên cứu.

Triệu chứng lâm sàng, cá bị nhiễm rsiv có biểu hiện lờ đờ, bơi bất thường, cơ thể chuyển màu đen, đặc biệt là phần cuối thân, mang nhợt nhạt. Cá bệnh nặng nổi lên tầng mặt sau đó từ từ chìm xuống đáy và chết, nên gọi là bệnh “cá ngủ”. Cá bị bệnh có biểu hiện loét vây, xuất huyết ở da và mang, lá lách và thận, sưng to, tích dịch trong xoang bụng. Các đại thực bào bắt màu bazơ khi nhuộm Giemsa trong mô lách, thận, mang, tim và gan.

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp sinh học phân tử bước đầu tiên cần lấy mẫu cá có kích thước < 4 cm. Lấy nguyên con, từ 10 đến 15 con. Cá có kích thước từ 4 đến 6 cm nên lấy nguyên con, từ 5 đến 10 con hoặc lấy lách, thận, tim, ruột, mang của từ 5 đến 10 con. Cá có kích thước > 6 cm lấy nguyên con, từ 3 đến 5 con hoặc lấy lách, thận, tim, ruột, mang của từ 3 đến 5 con. Cá bố mẹ lấy mang của từ 1 đến 3 con.

Nên bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 2°C đến 8°C không quá 48 h từ khi lấy mẫu đến khi vận chuyển về phòng thí nghiệm hoặc bảo quản trong ethanol 70% đến ethanol tuyệt đối với tỷ lệ 1:10 (1 phần mẫu : 9 phần ethanol). Đối với các mẫu bệnh phẩm xét nghiệm bằng phương pháp nuôi cấy vi rút trên môi trường nuôi cấy tế bào cần giữ trong các dụng cụ chứa môi trường nuôi cấy tế bào và bảo quản ở nhiệt độ từ 2°C đến 8°C.

Khi bảo quản trong phòng thí nghiệm mẫu được được bảo quản ở nhiệt độ từ 2°C đến 8°C chuyển đến phòng thí nghiệm chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20°C đến âm 80°C hoặc được bảo quản trong dung dịch PBS theo tỷ lệ 1:10 (1 phần mẫu: 9 phần PBS) ở nhiệt độ âm 20°C đến âm 80°C hoặc bảo quản trong ethanol 70% đến ethanol tuyệt đối.

Về tách chiết ADN nên sử dụng bộ kít tách chiết thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phương pháp PCR phát hiện vi rút này sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc sản phẩm PCR.

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi đối chứng âm không có vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại); Đối chứng dương có vạch sáng kích thước 568 bp phát hiện vi rút RSIV gây bệnh RSIVD. Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.

Với điều kiện phản ứng trên mẫu xét nghiệm âm tính với  vi rút này khi tại giếng của mẫu thử không xuất hiện vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại). Mẫu xét nghiệm dương tính với  vi rút khi tại giếng của mẫu thử có xuất hiện vạch sáng kích thước 568 bp. Kết quả của phản ứng realtime PCR được xác định dựa vào chu kỳ ngưỡng.

Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính. Mẫu đối chứng dương (có giá trị Ct đã biết trước) phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct ±2 Ct đã biết trước.

Kết quả phản ứng realtime PCR phát hiện vi rút Megalocityvirus: Mẫu có giá trị Ct < 38 được xem là dương tính. Mẫu không có giá trị Ct là âm tính. Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 38 ≤ Ct ≤ 45 được xem là nghi ngờ.

Lưu ý, những mẫu nghi ngờ, cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiêm tương đương khác để khẳng định kết quả. Phản ứng realtime PCR phải bao gồm mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm. Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng. Phân lập RSIV trên môi trường tế bào phải được chuẩn bị trước, lượng môi trường chuẩn bị căn cứ vào số mẫu cần phân lập vi rút.

Đánh giá kết quả bằng cách kiểm tra hệ thống đối chứng âm (đối chứng tế bào): Tế bào phát triển bình thường. Mẫu âm tính là mẫu sau 3 lần gây nhiễm không xuất hiện CPE. Mẫu dương tính là mẫu xuất hiện CPE và có kết quả thử nghiệm dương tính rsiv bằng kỹ thuật PCR.

Cá được xác định mắc bệnh do rsiv ở cá biển khi có những đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh và có kết quả dương tính với rsiv bằng phương pháp PCR hoặc có kết quả dương tính với Megalocityvirus bằng phương pháp realtime PCR đồng thời có kết quả dương tính với rsiv bằng phương pháp PCR hoặc có kết quả dương tính bằng phương pháp phân lập vi rút từ bệnh phẩm trên môi trường tế bào.