TCVN 8710-8:2023 về quy trình chẩn đoán bệnh hoại tử cơ ở tôm

Vi rút gây bệnh hoại tử cơ IMNV là vi rút thuộc Chi Giardiavirus lamblia, họ Totiviridae. IMNV có hình dạng tứ diện và đường kính 40nm, mật độ nổi 1.366 g/ml. Bộ gen bao gồm một phân tử ARN đơn, chuỗi kép (ds) có kích thước 8226-8230 bp.

Các loài tôm dễ nhiễm vi rút như tôm thẻ chân trắng, tôm sú, tôm sú nâu, tôm chuối, tôm xanh Nam Mỹ và tôm nâu phương nam. Các cơ quan và mô đích bị nhiễm vi rút như cơ thịt (cơ vân), mô liên kết, tế bào máu và các tế bào nhu mô của cơ quan lymphoid.

Vi rút IMNV thường gây tỷ lệ chết cao nhất cho tôm thẻ chân trắng từ 40 đến 70% tổng đàn. IMNV có thể xảy ra ở bất kỳ giai đoạn phát triển nào của tôm và là một bệnh nhiễm trùng mãn tính. Tỷ lệ tử vong có thể lên tới 70% vào cuối chu kỳ nuôi.

Lứa tuổi mắc bệnh tôm thẻ chân trắng ở giai đoạn tôm giống và tiền trưởng thành thường nhạy cảm nhất với mầm bệnh. Bệnh có thể lây truyền theo chiều ngang, con tôm bệnh lây sang con tôm khỏe hoặc lây truyền qua môi trường nước. Nhiệt độ và nồng độ muối được xem là một trong những yếu tố môi trường có ảnh hưởng đến quá trình phát bệnh của bệnh hoại tử cơ.

Tôm bị bệnh hoại tử cơ ở giai đoạn cấp tính xuất hiện các vùng hoại tử trắng rộng ở các cơ vân như phần cơ bụng và cơ đuôi, đặc biệt là phần bụng dẫn đến hiện tượng hoại tử. Sau khi chết các phần này có màu đỏ tương tự như màu của tôm nấu chín.

Tôm nhiễm IMNV trở nên lờ đờ và giảm ăn, có màu trắng đục cơ, thường nổi bật hơn ở tôm thẻ chân trắng so với tôm xanh và tôm sú. Kích thước của cơ quan bạch huyết của tôm nhiễm IMNV tăng gấp 2 đến 4 lần so với kích thước thông thường.

Tuy nhiên việc xác định bệnh hoại tử cơ ở tôm sớm trong nuôi trồng thủy sản không phải đơn giản. Do đó để xác định được bệnh kịp thời và chính xác nên tuân thủ theo hướng dẫn tại Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-8:2023 Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 8 bệnh hoại tử cơ ở tôm do Bộ Khoa học và Công nghệ công bố. 

Việc xác định bệnh hoại tử ở tôm theo hướng dẫn của tiêu chuẩn quốc gia giúp hạn chế được mầm bệnh lây truyền. Ảnh minh họa

Về chẩn đoán lâm sàng, trước hết tiêu chuẩn này chỉ ra các đặc điểm dịch tễ để nhận biết bệnh hoại tử cơ ở tôm. Đây là bệnh truyền nhiễm do tác nhân infectious myonecrosis virus (IMNV) gây ra ở tôm. Tôm bị bệnh hoại tử cơ ban đầu cơ đuôi có hiện tượng màu trắng đục sữa, sau đó lan dần khắp cơ thể. Tôm bị bệnh nặng có hiện tượng hoại tử và đỏ ở phần cơ này.

Quy trình chẩn đoán bệnh bằng cách lấy mẫu để xác định, theo đó số lượng tôm trên mỗi mẫu phụ thuộc vào kích cỡ của tôm. Đối với tôm giống, ấu trùng và hậu ấu trùng nên lấy nguyên con, từ 100 mg đến 500mg/ mẫu. Tôm thương phẩm lấy nguyên con, từ 5 con/mẫu đến 10 con/mẫu hoặc lấy mang, máu, biểu mô dưới vỏ kitin, chân bơi của 5 con/mẫu đến 10 con/mẫu. Tôm bố mẹ nên lấy nguyên con, 1 con/mẫu hoặc lấy mang, chân bơi của 1 con/mẫu.

Thu mẫu tôm có dấu hiệu bệnh lý, còn sống hoặc mới chết. Mẫu bệnh phẩm phải được lấy vô trùng và để riêng biệt trong dụng cụ chứa mẫu. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 2°C đến 8 °C không quá 48 h từ khi lấy mẫu đến khi vận chuyển về phòng thí nghiệm hoặc bảo quản trong ethanol 70 % đến ethanol tuyệt đối với tỷ lệ 1:10.

Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C chuyển đến phòng thí nghiệm chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc được bảo quản trong dung dịch PBS (dung dịch muối cân bằng) theo tỷ lệ 1:10 (1 phần mẫu: 9 phần PBS) ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc bảo quản trong ethanol từ 70 % đến ethanol tuyệt đối.

Để chuẩn bị mẫu nên dùng panh, kéo vô trùng để thực hiện các thao tác tách, cắt lấy mẫu. Mẫu được chia thành hai phần, một phần cho thực hiện xét nghiệm và một phần lưu trữ. Lượng mẫu lấy để tách chiết ARN khoảng 30 mg. Cho 30 mg mẫu vào dung dịch PBS với tỷ lệ 1:10 đồng nhất mẫu bằng máy nghiền mẫu hoặc bằng cối, chày nghiền mẫu để tạo thành huyễn dịch 10 %. Chuyển huyễn dịch vào 2 ống vô trùng đóng nắp, một ống mẫu để xét nghiệm và một ống lưu mẫu. Lưu ý với mẫu đã bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C cần rã đông ngoài nhiệt độ phòng trước khi thực hiện đồng nhất mẫu. Yêu cầu về tách chiết ARN nên sử dụng bộ kít tách chiết thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Sử dụng phương pháp Nested RT-PCR- Nested RTPCR (là phương pháp chẩn đoán nhanh, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, định ARN trong nhiều loại mẫu bệnh phẩm khác nhau. Kết quả của xét nghiệm nhận được trong vòng 24 giờ kể từ khi nhận mẫu, ngược lại, phương pháp phân lập vi rút phải mất 3 hay 4 tuần) sử dụng cặp mồi đặc hiệu để phát hiện vi rút gây hoại tử cơ ở tôm.

Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 μm làm gốc. Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 μm sau đó pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen PCR theo phương pháp Nested RT- PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút gây bệnh hoại tử cơ ở tôm sử dụng cặp mồi 4587F/ 4914R và 4725F/4863R.

Phương pháp tách chiết ARN realtime RT - PCR bằng cách sử dụng bộ kít tách chiết ARN thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy realtime PCR theo phương pháp realtime RT- PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút gây hoại tử cơ sử dụng cặp mồi IMNV142F / IMNV545R và đoạn dò Taqman IMNV-p1.

Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 μM làm gốc. Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 μM pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (là một loại enzym có khả năng cắt liên kết).

Phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE nên lấy mẫu bằng cách tôm ấu trùng, hậu ấu trùng sử dụng nguyên con. Tôm bố mẹ, tôm thương phẩm lấy nguyên con hoặc bộ phận đầu ngực có chứa khối gan tụy (< 1 cm3), cố định mẫu trong dung dịch thử Davidson ngay sau khi lấy mẫu với tỷ lệ mẫu và dung dịch Davidson. Mẫu cố định trong Davidson chuyển đến phòng thí nghiệm trong khoảng từ 24 h đến 72 h sau khi lấy mẫu. Mẫu cố định trong Davidson khoảng từ 24 h đến 72 h. Mẫu được chuyển sang ethanol 70%. Lấy bệnh phẩm đã cố định trong ethanol hoặc Davidson cắt miếng nhỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm cho vào khuôn nhựa.

Tiến hành xử lý mẫu bằng cách cắt tiêu bản và nhuộm tiêu bản tiêu bản Haematoxylin và Eosin theo hướng dẫn. Đọc kết quả bằng cách soi kính hiển vi từ vật kính có độ phóng đại thấp đến vật kính có độ phóng đại cao. Khi tôm bị bệnh IMNV, kết quả mô bệnh học cho thấy các vị trí hoại tử ở các sợi cơ vân và có hiện tượng viêm, phù, xuất huyết giữa các sợi cơ, xuất hiện thể ẩn trong tế bào chất. Tôm bị nhiễm IMNV nặng, phần cơ ở bụng bị hoại tử nghiêm trọng và sự xâm nhập với số lượng lớn của các tế bào máu vào vùng bị viêm.

Mẫu tôm được xác định mắc bệnh hoại tử cơ (IMNV) khi có những đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đặc trưng của bệnh và có kết quả dương tính với IMNV bằng phương pháp Nested RT- PCR hoặc có kết quả dương tính với IMNV bằng phương pháp realtime RT- PCR hoặc phát hiện được bệnh tích vi thể đặc trưng bằng phương pháp nhuộm HE.